king……………………………………………………………………………..51
جدول3-1- ویژگی های فیزیکو شیمیایی nsLTP2 برنج ایرانی…………………………………………………………………..62
جدول 3-2-موتیف ها و محل قرار گیری آن ها روی توالی nsLTP2 برنج ایرانی……………………………………………63
جدول 3-3-نواحی آنتی ژن توالی پروتئینی nsLTP2 برنج ایرانی………………………………………………………………..64
جدول 3-4-نواحی آنتی ژنیک موجود در توالی nsLTP2 برنج ایرانی که با MHC-II واکنش می دهد……………66
جدول 3-5-نواحی آنتی ژن توالی پروتئینی nsLTP2 برنج ایرانی که اپی توپ های سلول B هستند…………………..66
جدول3-6-نتایج حاصل از جهش زایی پروتئین nsLTP2…………………………………………………………………………..67
جدول 4-1-میزان وقوع هر آمینو اسید در اپی توپ ها و پروتئین ها ………………………………………………………………..73
فصل اول
مقدمه
تاریخچه ی پروتئین LTP1
لیپید ها نقش ضروری را در بیولوژی دارند و به عنوان رابط بین اندامک ها،سلول ها و موجودات تعریف می شوند.این گروه از ملکول ها منبع غنی از انرژی را ارائه داده و می توانند به عنوان سیگنال های ملکولی و هورمونی مهم عمل کنند.لیپید های مورد نیاز قسمت های مختلف سلول های یوکاریوتی از جمله غشای پلاسمایی و غشای سایر اندامک ها در اندامک هایی همچون شبکه ی آندوپلاسمی و دستگاه گلژی ساخته و سپس به بخش های مورد نظر منتقل می شوند (Dowhen.1997;Jouhet et al .2007; Kent .1995;vance.2004).بدین ترتیب تبادل قابل توجهی از لیپید ها بین غشاهای سلولی مختلف وجود دارد که در یوکاریوت ها این پدیده از طریق مسیر های وزیکولی و غیر وزیکولی رخ می دهد( Maxfield and Mondal .2006).غشای اندامک هایی مثل گلی اکسی زوم ها شامل لیپید هایی مثل فسفاتیدیل کولین،فسفاتیدیل گلیسرول و فسفاتیدیل اتانول آمین است،در حالی که این اندامک فاقد آنزیم های مورد نیاز برای ساخت این فسفاتید ها می باشند.بنابراین این اندامک باید لیپید های لازم برای ساخت غشای خود رااز اندامک های سازنده ی آن وارد کند(Moreau et al . 1998).از طرف دیگر عموما لیپید ها دارای حلالیت ضعیفی در سیتوپلاسم سلول می باشند که این خود حضور یک سیستم انتقالی را ضروری می سازد.گروهی از پروتئین ها تحت عنوان انتقال دهنده ی لیپید(LTP) اولین بار از برگ های اسفناج استخراج شدند و بر اساس فعالیت و عملکردی که در انتقال فسفولیپید ها بین غشاها در حالت in vitro داشتند نامگذاری شدند (kader .1996). این پروتئین ها توانایی انتقال فسفولیپید ها،گلیکولیپید ها،اسید های چرب و استرول ها بین لیپید های غشایی از لیپوزوم ها یا میکروزوم ها به میتوکندری را دارند و در شرایط in vitro انتقال فسفولیپید ها را از یک غشای دهنده به یک غشای گیرنده تسهیل می کنند( kader (.1996;Yeast and Rose.2008).LTP ها از جمله فراوان ترین پروتئین ها در گیاهان هستند و بیش از 4% حجم پروتئین های محلول را تشکیل می دهند( Carvaho and Gomes et al. 2007;Edstam et al. 2011).
با توجه به فعالیت های واضح LTP های گیاهی در حالت in vitro در ابتدا این طور فرض می شد که این پروتئین ها فقط در تبادل لیپید ها در درون سلول نقش دارند،اما این ایده زمانی که نشان داده شد که LTP ها به عنوان پیش پروتئین هایی دارای سیگنال پپتید تولید شده Bernhard et al. 1997)) ،که به طور مستقیم به ماتریکس خارج سلولی ترشح می شوند رد شد (Meijer et al.1993;Thoma et al.1993).این پروتئین ها تاکنون از گیاهان مختلفی همچون گندم،جو،گیلاس،آرابیدوپسیس،ذرت،لوبیا،سیب،هلو،گوجه،تاج خروس و برنج استخراج شده اند( Cheng Hui – chun et al.2004. LTP.( ها علاوه بر انواع مختلف گیاهان (Wang et al.2004) در باکتری ها ،حیوانات و همچنین بافت های انسانی نیز یافت می شوند.اگر چه از نظر توالی LTPهای گیاهی و جانوری هیچ تشابهی ندارند اما شباهت زیادی بین LTP های گیاهی وجود دارد.در انواع مختلف ساختار گیاهی از جمله دیواره سلولی برگ،دمبرگ،ساقه،گل و دستجات آوندی LTP وجود دارد( Yeats and Rose . 2008)، این ملکول ها دارای PI حدود 10-8 می باشند. LTP ها قادر به انتقال طیف گسترده ای از لیپید ها از جمله انواع فسفولیپید ها،گلیکولیپید ها،استروئید ها و اسید های چرب بین غشاهای زیستی می باشند. بدین ترتیب دارای عملکرد غیر اختصاصی بوده و آنها را با نام عمومی 2ns – LTP می شناسند. این پروتئین های قلیایی کوچک بر اساس وزن ملکولی خود به دو گروه nsLTP1 با وزن ملکولی 9 کیلو دالتون و nsLTP2 با وزن ملکولی 7 کیلو دالتون تقسیم می شوند(Karimian et al.2011). این دو نوع ملکول ویژگی های مشترکی از جمله نقطه ایزوالکتریک بالا،وزن ملکولی پایین،هشت باقی مانده بسیار حفاظت شده از سیستئین که در تشکیل باند های دی سولفید درون ملکولی دخالت می کنند را به اشتراک گذاشته اند( Arondel and Kader.2000 ).با این حال علی رغم تشابهات کلی تفاوت هایی در وزن ملکولی،توالی اسید آمینه ای و فعالیت های بیولوژیکی دارند. (Samuel et al. 2002)
پروتئین های خانواده ی LTP1 دارای 90 تا 95 اسید آمینه و پروتئین های خانواده ی LTP2 دارای 70 اسید آمینه در ساختار اولیه خود می باشند. (Kader et al.1996) همچنین مطالعات کریستالوگرافی نشان داده که اختلاف در حفره ی هیدروفوب این دو پروتئین از مهمترین تفاوت های آنهاست.این حفره آب گریز در LTP1 به شکل یک تونل است که از محور ملکولی می گذرد و در LTP2 به صورت یک محفظه ی خالی هرمی است که حفره آب گریز در LTP2 دارای اندازه کوچکتر و انعطاف بیشتری نسبت به LTP1 می باشد.به این ترتیب LTP2 با داشتن این ویژگی توانایی اتصال به ملکولهای سختی همچون استرول ها را دارد (Elmorjani et al .2004). LTP ها از هر دو خانواده LTP1 و LTP2 در انتهای آمینی خود سیگنال پپتیدی دارند که در LTP1 33-24 اسید آمینه و در LTP2 36-24 اسید آمینه دارد( Garcia – Garrido et al .1998; Kalla et al .1994).مطالعات انجام شده در مورد LTP1 نسبت به LTP2 بیشتر است.در این مطالعات توالی نوکلئوتیدی و اسید آمینه ای،روند تخلیصی(Liu et al .2002; Padidar et al . 2009;Segura et al . 1993;Zaman et al . 2009)،فعالیت های زیستی مختلف از جمله فعالیت های انتقالی و اتصالیCheng Chao-sheng et al.2008))،خواص ضد قارچی و ضد میکروبی (Kirobakaran et al.2008 ;Yeats and Rose.2008 , Zottich et al.2011)و سایر خواص آن مورد بررسی قرار گرفته است.همچنین ویژگی های ساختاری این ملکولها توسط مطالعات بیوانفورماتیک(Lee et al . 1998) و تکنیک هایی از قبیل NMR و CD بررسی شده است. LTP ها دارای وظایف متعددی از جمله انتقال مونومر های کوتین،شرکت در مکانیسم دفاعی گیاهان،شرکت در روند تمایز سلولی،گرده افشانی،جوانه زنی و جنین زایی می باشد( Ekland and Edqvist et al .2003;Cheng Hui – Chun et al.2004). این پروتئین ها در برابر دمای بالا (تا 80 درجه)،ترکیبات دناتوره کننده و هضم آنزیمی مقاومند (Bernardi et al.2011)،ثبات قابل توجه در برابر پروتئولیز (Lindorff – Larsen and Winther.2007) و دناتوراسیون حرارتی ذاتا در ارتباط با خاصیت آلرژی زایی این پروتئین هاست (Breiteneder and Mills.2004)، به همین دلیل این پروتئین ها می توانند وارد سیستم هورمونی بدن انسان شوند و سیستم عصبی را تحریک کرده و به عنوان آلرژی عمل کنند( Bernardi et al. 2011) .
1-2-ساختار ژنی LTP ها
الگوهای بیانی که برای ژن های ltp مربوط به گیاهان مختلف وجود دارد پیچیده و در بیشتر موارد موقت و بسیار کنترل شده است (Vignols et al.1997 ; Guiderdoni et al. 2002)، LTP ها شامل یک خانواده چند ژنی هستند که متناسب با نیاز گیاه در اندام های مختلف تنظیم می شوند،به عنوان مثال LTP برنج توسط حداقل سه گروه ژنی کد می شود( Boutrot Freddy et al.2008 ; Garcia – Garrido et al.1998). بیان ژن های ltp در تغییر شرایط محیطی مثل خشکسالی،استرس های نمکی،سرما و آلودگی به بیماری زاهای باکتریایی و قارچی صورت می گیرد( Jung et al. 2003 ; Jang et al . 2004)،بنابراین LTP ها علل سازگاری گیاه در مقابل شرایط استرس زای غیر زنده مثل:افزایش غلظت نمک،سرما و تغییرات تابش نور می باشد، به این ترتیب که بیان ژن های ltp در زمان القاء این شرایط استرس زا افزایش می یابد.نشان داده شده است که LTP ها در هنگام القای نور آبی و قرمز یافت می شوند.همچنین ملکول هایی مانند سالیسیک اسید 5.اتیلن 6.متیل جاسمونات که ملکولی پیام رسان است و بیان ژن های پاسخ دهنده به عوامل بیماری زا را القا می کند در مسیر پیام رسانی مرتبط با بیان ژن ltp1در گیر است(Jung et al . 2003; Jung et al. 2006;Garcia – Garrido et al.1998; Sohal et al.1999;Terres – Schumann et al.1992).
اولین رمز گذاری cDNA یLTP گیاهی از کتابخانه cDNA ی ساخته شده از دانه های ذرت جدا شد Tchang) et al.1988 )و پس از آن ژن های متعدد ltp از گونه های مختلف گیاهی مثل آرابیدوپسیس تالیاناArondel et) al.2000 )،گوجه(Terres- Schumann et al.1992 ;Trevino and O Connel et al.1998)، ذرت(Sossountzov et al.1991) ،فلفل(Jung and Hwang.2000; Park et al.2002 )،جو(Molina and Garcia -Olmedo.1993 ;Molina et al . 1996) و برنج(Vignols et al.1994)‌جدا شدند.
در جو بر اساس هومولوژی توالی و محل کروموزوم ها،ژن های ltp می توانند